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產(chǎn)品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產(chǎn)品英文名稱：Mitochondrion Staining Kit (Green Fluorescence)

產(chǎn)品中文名稱：線粒體染色試劑盒（綠色熒光）

規(guī)格：100 T/500 T/2000 T

貨號(hào)：EY-01X8557
用途：僅供科研研究實(shí)驗(yàn)

特點(diǎn)&優(yōu)勢(shì):

•  能夠在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中進(jìn)行線粒體染色，主要是活細(xì)胞，包含懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞。

•  針試劑盒針對(duì)各種熒光分析平臺(tái)進(jìn)行了優(yōu)化，具有廣泛的適用性，如熒光微孔板分析，流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡等。

•  的MitoGreen•  (Ex/Em = 490/523 nm)- 對(duì)線粒體膜電位勢(shì)能的依賴性更低。

保存建議:請(qǐng)參閱說明書中各個(gè)組分的存儲(chǔ)條件。自發(fā)貨之日起，在推薦溫度下至少穩(wěn)定6個(gè)月。

運(yùn)輸條件:藍(lán)冰運(yùn)輸

背景

線粒體是一種雙膜結(jié)合的細(xì)胞器，存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中。線粒體的功能是提供細(xì)胞能量。此外，線粒體參與其他任務(wù)，如信號(hào)傳遞、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡，以及維持對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)的控制。線粒體與多種人類疾病有牽連，包括線粒體疾病、心臟疾病、心力衰竭和孤癥。線粒體可能在這些細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。

本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):

 1.操作簡(jiǎn)便、快捷。可直接加入到檢測(cè)平板。在96-孔板中檢測(cè)時(shí),無需洗滌或收獲細(xì)胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發(fā)性的有機(jī)溶劑來溶解甲臜產(chǎn)物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數(shù)后可放回溫箱繼續(xù)孵育,使顏色進(jìn)一步生成。

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

(二)構(gòu)建重組表達(dá)載體

1、載體酶切:將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點(diǎn))進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標(biāo)志(抗Amp或藍(lán)白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

(四)誘導(dǎo)表達(dá)

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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